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關于大腸菌群平板計數法的一些實踐經驗分享!

一、VRBA培養相關問題
1.所用器皿是否需要滅菌?
答:不需要。配制培養基所用到的錐形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要滅菌,但要求一定要清洗干凈,表面無污漬、無殘留。煮沸完成后,取下錐形瓶,用一般常用的衛生紙(軟紙)覆蓋瓶口,用橡皮筋纏繞,待冷卻至適宜溫度即可傾注培養基。在傾注培養基時,須點燃酒精燈,稍微灼燒錐形瓶口。

2.如何保持“煮沸2min”?
答:可以用電磁爐或電熱板進行加熱煮沸,在該培養基即將煮沸時調低溫度。實際操作時,不需要嚴格按照此要求進行,加熱煮沸數秒即可。原因:本培養基很難保持煮沸2min,一旦煮沸,則培養基很快上涌、翻騰,若不調低溫度或立刻采取其他措施,則培養基可在數秒內噴涌出來,嚴重者可噴涌2米以上、電磁爐周圍1—2米范圍內都是培養基飛濺的范圍(實驗室危險因子之一)。


3.若培養基未用完,是否可以冷藏起來下次用?
答:不可以。4789.28中已規定,固體培養基最多允許熔融1次(指的是經過高壓滅菌冷卻后的培養基還可以熔融一次后使用)。且VRBA培養基冷卻后,再次熔融時非常容易噴涌,若溫度控制不當,底部培養基熔融后很快就會發生噴涌(即培養基未完全熔融就會發生噴涌現象)


4.傾注完成后是否需要“覆蓋一層”?如何覆蓋?
答:一般情況下不需要覆蓋。在實際操作過程中,若檢驗員初次接觸該食品(或食品品類),則有必要在傾注培養基后再覆蓋一層(原因是不清楚該樣品是否會發生蔓延)。而如此往復測試幾次后,若該樣品或食品品類均不存在蔓延現象,則以后的實驗中都不需要進行覆蓋。若重復多次測試后都有蔓延現象,則以后的檢驗中最好都進行覆蓋,最好是在原培養基已凝固或半凝固(不會發生晃動)時再傾注一層培養基(“一層”是指緩慢傾注培養基至培養基剛好能夠覆蓋整個平皿)。



二、如何確定培養基上長的是不是大腸菌群?
答:不要去管什么是大腸菌群的典型形態,建議新手們認真按照標準進行證實試驗,此證實試驗非常簡單,每一次VRBA上有菌落生長都進行證實試驗,如此往復3-4次,對于哪種形態才是大腸菌群已經能夠了然于心了。建議平時多配一些BGLB肉湯管冷藏儲存備用,需要進行證實試驗時分分鐘可以完成試驗(BGLB肉湯管一般可儲存2-3個月,建議配制10-20管左右,不要配制太多,證實試驗很少做)。



三、兩個梯度都長了菌,如何選取?

答:選取15-150CFU之間的平板(指的是VRBA平板上所有菌落數在此范圍),挑取可疑菌落進行證實試驗。詳細舉例說明:若有兩個連續梯度的4個平板上菌落數均在15-150之間,則4個平板上的菌落都要挑取進行證實試驗,實際操作時,可靈活操作,如:1:10的兩個平板上的菌落數分別為120、123,1:100的兩個平板的菌落數分別為16、18,嚴格來講必須至少在每個平板上分別挑取5個可疑菌落、5個典型菌落進行證實試驗,如此需要40根BGLB肉湯管。建議使用鎳合金接種環(即傳統的接種環,而不是一次性塑料接種環),因為VRBA上生長的菌落(無論典型或可疑)大部分長在底層、且菌落一般較大,被培養基覆蓋,傳統的接種環較細,用以刮去上層培養基較方便,挑取菌落也較方便。


四、如何進行證實試驗?菌落選取數量?
答:同上所述,建議新手們VRBA上的所有不同形態的菌落都進行證實試驗。每種不同形態都挑取5個進行證實試驗(若BGLB管足夠,建議多挑取幾個進行試驗)。
注意:A.每種可疑菌落挑取5個,每個菌落放入1管GBLB管中;B.“產氣者,記為大腸菌群陽性管”,就要求在實驗前須認真篩選BGLB管,凡產氣的GBLB管應棄去不用。



五、結果如何計算?
答:首先,在VRBA培養24h后進行計數,分別計數可疑大腸菌群和典型大腸菌群(何為可疑、何為典型?同“2”,檢驗員多進行幾次實驗后自然很清楚典型的大腸菌群是何種形態)的數量。假如在1:10的平板上可疑大腸菌群有10個,典型大腸菌群有6個;證實實驗應該按照可疑跟典型5:3的比例進行挑選。

例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為:100*6/10*104/g(mL)=6.0*105 CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。



六、若平板上很多菌落,最終證實全部為陰性,結果如何計算?
答:首先是證明提問者沒有認真看標準。 “很多”是多少?是否在15—150范圍內?是哪一個稀釋度?根據第3條,選取適宜菌落數的平板挑取菌落進行證實試驗,若證實全部為陰性,則需要再挑取更低稀釋度的平板上的菌落(建議可疑和典型菌落分別挑取10個)進行證實試驗,若第二次證實試驗均呈陰性,以<1乘以最低稀釋度進行計算,如:1:10的平板菌落數分別為120、123,1:100的平板上菌落數分別為16、18,首先挑取1:100的兩個平板上的菌落進行證實試驗,若全部為陰性,再挑取1:10的兩個平板上的菌落進行證實試驗,若1:10的平板上的菌落數證實為陰性,則最終計算過程為<1x10,最終結果為<10;若1:10的的平板上的菌落有陽性管,則按照第5條進行計算。

 
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